Conceitos básicos sobre as características de um método. Breve visão geral da validação e da verificação de métodos.

Porque é que a terminologia é importante?

No mundo das análises laboratoriais, a precisão da linguagem é tão importante como a precisão da medição. Uma compreensão inadequada dos conceitos básicos pode levar a uma interpretação incorreta dos resultados, a problemas com a acreditação ou a mal-entendidos com os clientes do laboratório.

Quando um laboratório obtém um resultado de ensaio com o valor «detetado abaixo do limite de quantificação», cada membro da equipa tem de compreender exatamente o que isso significa e em que difere de «não detetado». Quando um auditor pergunta pela diferença entre repetibilidade e reprodutibilidade, a resposta tem de ser inequívoca.

Consequências dos mal-entendidos

Muitas vezes verificou-se que um cliente que ensaiava o mesmo lote de produto em laboratórios diferentes obtinha resultados aparentemente diferentes. Normalmente, a causa não são erros técnicos, mas mal-entendidos fundamentais sobre o que medimos e como o medimos, e sobre a forma como interpretamos os resultados ou os limites do método.

Verificação vs. validação — parecidas, mas não iguais

Estes dois termos são frequentemente usados como sinónimos, o que gera confusão. No entanto, representam dois processos fundamentalmente diferentes no laboratório.

Verificação do método

A verificação responde à pergunta: «Este método conhecido funciona corretamente no nosso laboratório?»

Quando um laboratório implementa um método normalizado, por exemplo uma norma ISO, não está a criar nada de novo. O método já foi desenvolvido e exaustivamente testado. A verificação consiste em confirmar que, nas condições específicas de um dado laboratório — com o seu equipamento, reagentes, pessoal e procedimentos —, este método funciona como esperado.

Exemplo de verificação

Um laboratório implementa um método espectrofotométrico normalizado de determinação do ferro na água, descrito numa norma. Realiza uma série de ensaios com materiais de referência certificados e verifica se os resultados se enquadram nos limites aceitáveis. Isto é a verificação — a confirmação de que um método conhecido funciona connosco como deve.

Validação do método

A validação é um processo muito mais complexo, que responde à pergunta: «Este método novo ou modificado é adequado ao fim a que se destina?»

A validação é realizada quando um laboratório desenvolve um método próprio, modifica um existente, aplica um método conhecido a um novo tipo de amostra ou utiliza um método que não tem uma validação primária completa. O processo de validação exige o estudo exaustivo de todos os parâmetros que caracterizam o método e a demonstração de que este cumpre os requisitos. Basta realizá-la uma vez, aquando da introdução do método; as verificações posteriores do desempenho do método devem basear-se na verificação do método.

Aspeto	Verificação	Validação
Tipo de método	Método normalizado com validação primária completa	Método novo ou modificado
Objetivo	Confirmação do desempenho	Caracterização completa
Âmbito	Processo mais curto	Processo abrangente
Parâmetros	Menos parâmetros	Todos os parâmetros

Precisão e exatidão — o coração da qualidade da medição

Compreender a diferença entre precisão e exatidão é crucial para interpretar os resultados laboratoriais. Ambos os conceitos descrevem a qualidade da medição, mas de perspetivas completamente diferentes.

Precisão — o agrupamento dos resultados

A precisão indica até que ponto os resultados de medições repetidas da mesma amostra concordam entre si. Um método preciso produz resultados agrupados próximos uns dos outros, mesmo que estejam todos desviados do valor verdadeiro.

Imagine que está a disparar sobre um alvo — a precisão é o agrupamento de todos os tiros numa área pequena. Podem acertar ao lado do centro, mas, se estiverem próximos uns dos outros, a precisão é elevada.

Repetibilidade e reprodutibilidade

Repetibilidade é a concordância dos resultados obtidos em condições idênticas: o mesmo analista, o mesmo equipamento, os mesmos reagentes, um tempo de análise tão próximo quanto possível.

Reprodutibilidade é a concordância dos resultados obtidos em condições alteradas: analistas diferentes, equipamento diferente, momentos diferentes. É uma imagem mais realista do que podemos esperar na prática.

Exatidão — a proximidade da verdade

A exatidão determina o quão próximo o resultado da medição está do valor verdadeiro. Um método exato dá resultados próximos do teor real da substância na amostra.

Voltando à analogia do alvo — a exatidão é acertar no centro. Podemos ter uma exatidão elevada (a média de muitos tiros está no centro), mesmo que os tiros individuais estejam bastante dispersos.

Quatro cenários da qualidade da medição

Precisão elevada e exatidão elevada: situação ideal — resultados agrupados e próximos do valor verdadeiro
Precisão elevada, exatidão baixa: resultados próximos uns dos outros, mas sistematicamente desviados (erro sistemático)
Precisão baixa, exatidão elevada: resultados dispersos, mas próximos do valor verdadeiro
Precisão baixa e exatidão baixa: resultados caóticos e incorretos — o método exige intervenção

Limite de deteção e de quantificação — onde termina a nossa visão

Todo o método analítico tem as suas limitações. Abaixo de um determinado nível de concentração, não conseguimos detetar nem medir nada com a certeza adequada. É aqui que entram dois conceitos essenciais.

Limite de deteção (LOD)

O limite de deteção é a concentração mais baixa de uma substância que ainda conseguimos detetar com uma probabilidade definida (por exemplo, 95%) — distinguir do ruído de fundo —, mas que não conseguimos medir com exatidão.

É como olhar para as estrelas à noite — consegue ver um ponto de luz muito ténue e dizer «sim, há ali alguma coisa», mas não consegue determinar com que intensidade brilha nem qual o tamanho dessa estrela.

Limite de quantificação (LOQ)

O limite de quantificação é a concentração mais baixa de uma substância que conseguimos não só detetar, mas também medir quantitativamente com a precisão e a exatidão adequadas.

Continuando a analogia — é o nível de brilho a partir do qual consegue não só confirmar a presença de uma estrela, mas também estimar o seu brilho e o seu tamanho com uma certeza razoável.

Cenário prático

Um método de determinação de pesticidas na água para consumo humano tem um LOD de 0,01 µg/l e um LOQ de 0,03 µg/l. O valor-limite legal é de 0,1 µg/l.

Um resultado de 0,02 µg/l significa que o pesticida foi detetado, mas não pode ser considerado um valor quantitativo fiável. O relatório deve conter a informação «detetado abaixo do limite de quantificação», e não um número concreto.

Linearidade e gama — a zona de conforto do método

Linearidade do método

A linearidade é a capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra. Em termos simples — quando se duplica a concentração, o sinal também deve duplicar.

A linearidade perfeita é o ideal a que aspiramos. Na prática, há sempre alguns desvios em relação à reta ideal. A questão-chave é: estes desvios são suficientemente pequenos para os podermos aceitar?

Gama de trabalho do método

A gama de trabalho do método define o intervalo de concentrações da substância em que o método funciona com a linearidade, a precisão e a exatidão adequadas. É a «zona de conforto» do método — a área em que podemos confiar nele.

O perigo da extrapolação

O erro mais comum na prática laboratorial é a extrapolação para além da gama estabelecida do método. O resultado pode parecer sensato, mas a sua fiabilidade é questionável. É sempre melhor diluir ou concentrar a amostra para a colocar dentro da gama de trabalho do método do que arriscar cálculos incertos.

Seletividade e especificidade — estamos a medir o que pensamos?

Estes dois termos são frequentemente usados como sinónimos, embora, tecnicamente, descrevam aspetos ligeiramente diferentes da mesma característica do método.

Especificidade

A especificidade é a situação ideal em que só e exclusivamente o nosso analito gera um sinal. Nenhuma outra substância presente na amostra afeta o resultado ou dá resultados falsos. É o nível mais elevado de seletividade.

Seletividade

A seletividade é uma abordagem mais pragmática — o método consegue determinar o analito ou o grupo de analitos que nos interessa na presença de outras substâncias que possam estar presentes na amostra.

Como testar a seletividade?

O laboratório testa a seletividade analisando amostras que contêm o analito (ensaio positivo) e amostras sem o analito, mas com potenciais substâncias interferentes (ensaio negativo). Se o método for seletivo, o ensaio negativo não deve dar um resultado falso positivo.

Recuperação — estamos a obter tudo o que adicionámos?

A recuperação é um dos indicadores da qualidade do método mais simples e intuitivos. Mostra que percentagem de uma quantidade conhecida de analito adicionado conseguimos medir.

O que afeta a recuperação?

Perdas durante a preparação da amostra: extração, evaporação, filtração — cada passo pode provocar perdas
Efeito de matriz: os componentes da amostra podem afetar a eficiência da determinação
Degradação do analito: algumas substâncias decompõem-se durante a preparação ou a análise
Erros sistemáticos: calibração incorreta ou interferências

Valores de recuperação aceitáveis

Para os componentes principais, esperamos normalmente uma recuperação na gama de 95–105%. Para os analitos vestigiais, aceitamos uma gama mais ampla — 80–120%. Estes limites têm em conta as maiores dificuldades técnicas a concentrações muito baixas.

Estabilidade do método — posso confiar nele amanhã?

A estabilidade (por vezes designada flexibilidade ou robustez) de um método determina o quão sensível este é a pequenas alterações deliberadas das condições de medição.

Porquê testar a estabilidade?

O teste da estabilidade permite responder a questões essenciais:

Que parâmetros do método exigem um controlo rigoroso?
Com que precisão tenho de controlar a temperatura, o pH, o tempo de reação?
Posso introduzir pequenas modificações sem perder qualidade nos resultados?
O que acontece quando algo não corre como planeado?

Exemplo de teste de estabilidade

O método exige um pH de 7,0. O laboratório testa o que acontece com um pH que difere algumas décimas. Se os resultados se mantiverem aceitáveis, o método é estável em relação a pequenas alterações do pH. Se os resultados mudarem significativamente já com um pH que difere algumas décimas, o pH exige um controlo muito rigoroso e deve ser descrito com precisão no procedimento.

Incerteza de medição

A incerteza de medição é uma estimativa do intervalo de valores no qual, com uma probabilidade definida, se encontra o valor verdadeiro da grandeza medida.

Fontes de incerteza

A incerteza de medição provém de muitas fontes:

Precisão do método (dispersão dos resultados de medições repetidas)
Operações realizadas sobre a amostra (amostragem, pesagem, etc.)
Exatidão dos padrões e dos materiais de referência
Parâmetros do equipamento (pipetas, balanças, balões volumétricos)
Condições ambientais (temperatura, humidade)
Competências do pessoal
Efeitos da matriz da amostra

Porque é que a incerteza é importante?

Quando um laboratório comunica um resultado como «10 mg/l ± 2 mg/l», o cliente sabe que o valor verdadeiro se situa, muito provavelmente, entre 8 e 12. Isto permite-lhe tomar decisões informadas, sobretudo quando o resultado está próximo de um valor-limite legal ou de uma norma de qualidade.

Confirmação da validade dos resultados — garantir a qualidade dos ensaios

Importa sublinhar que os métodos introduzidos, validados e verificados, têm de estar abrangidos por um programa de monitorização da validade dos resultados. Todos os elementos que o compõem devem ser considerados e cumpridos de acordo com a secção 7.7 da norma PN-EN ISO/IEC 17025:2018-02.

O laboratório deve avaliar regularmente a eficácia dos métodos de monitorização da validade dos resultados que aplica e documentar os resultados dessas avaliações. Se se verificar que os procedimentos aplicados não asseguram um controlo da qualidade suficiente, devem ser devidamente modificados ou complementados.

Resumo — a nomenclatura correta

A terminologia relativa às características dos métodos não é um conjunto de definições áridas para decorar para um exame. É uma linguagem comum de comunicação entre laboratórios, auditores, clientes e organismos reguladores. O uso preciso destes conceitos é sinal de profissionalismo e garantia da qualidade do trabalho do laboratório.

Compreender estes termos permite:

Conceber e implementar corretamente métodos analíticos
Comunicar as limitações e as capacidades dos métodos
Interpretar os resultados no contexto da sua incerteza
Cumprir os requisitos das normas e da acreditação
Conquistar a confiança dos clientes através da transparência

Conclusão principal

Num laboratório analítico, não basta medir bem — é também preciso compreender e comunicar bem o que se mede, com que qualidade se mede e quais são as limitações do método. É isto que distingue um laboratório profissional de uma abordagem amadora à análise.

O artigo foi preparado com base nos requisitos da norma PN-EN ISO/IEC 17025:2018-02 «Requisitos gerais de competência para laboratórios de ensaio e calibração» e nas recomendações atuais apresentadas no XXVIII Simpósio POLLAB 2023 sobre validação, verificação e garantia da validade dos resultados. O conteúdo foi verificado quanto à correção técnica e linguística, para apoiar os laboratórios na aplicação prática dos princípios da metrologia e da qualidade da medição.